La Liga-førende Real begyndte deres jagt på en rekordstor 15. europæisk triumf med en 1-0-sejr på hjemmebane over Union Berlin i sidste måned, mens de italienske mestre Napoli, som i øjeblikket er nummer tre i Serie A, vandt 2-1 over Sporting Braga.
Tirsdagens opgør på Diego Armando Maradona Stadium kan blive afgørende for begge holds mål om at tage førstepladsen i gruppe C.
"Vi skal spille mod et af de bedste hold i Italien. De gjorde det rigtig godt sidste år. Det bliver en jævnbyrdig kamp, da de har et højt niveau," sagde Ancelotti, som engang var manager for Napoli, på en pressekonference.
"Det bliver den sværeste kamp i gruppespillet for os. Jeg vil ikke sige, at vi er vant til det, men klubbens trøje hænger tungt på os."
Kampen bliver også Ancelottis tilbagevenden til Napoli, efter at han stod i spidsen for 73 kampe i klubben fra 2018 til 2019 og førte holdet ubesejret gennem Champions League-gruppespillet, inden han blev fyret mens holdet lå på syvendepladsen i Serie A.
"Jeg havde positive øjeblikke, det er en vidunderlig by. Der var også mindre gode øjeblikke, men jeg har et minde om en positiv oplevelse," siger Ancelotti.
"Det giver ikke mening at gå tilbage før en kamp som denne. Når forholdet mellem en klub og en træner ikke føles rigtigt, er det bedre at stoppe.
"Jeg tror, det var den rigtige beslutning for Napoli og for mig, for to år senere kom jeg tilbage til den bedste klub i verden."
Real Madrid og Napoli mødtes sidst i Champions League i ottendedelsfinalerne i 2016/17, hvor de spanske giganter vandt begge opgør med 3-1 og vandt titlen.